Kajian dan penilaian karsinogenesis

Karsinogenesis dikaji dengan pelbagai ujian toksikologi standard. Bahagian pertama ujian ini dijalankan secara in vitro, dan - jika positif - kami meneruskan eksperimen in vivo. Pendekatan langkah demi langkah eksperimen ini dipanggil DECISION POINT APPROACH, urutan percubaan yang berhenti pada akhir setiap percubaan untuk memutuskan bagaimana meneruskan perbicaraan. Terdapat lima peringkat:

FASA A: struktur dan ciri sebatian karsinogenik;

PHASEB: dalam fasa ujian in vitro jangka pendek ini, sel mamalia digunakan. Sel yang paling sering digunakan adalah hepatosit, kerana sejauh mana tahap perbaikan terhadap kerosakan yang dialami oleh hepatosit sesuai dengan keparahan kerosakan yang disebabkan oleh bahan tersebut dikaji. Singkatnya, kami menentukan bukan kerosakan itu sendiri, tetapi berapa banyak sistem pembaikan yang telah diaktifkan oleh sel hati.

Prosedur yang dilaksanakan adalah untuk membentuk 3 kultur hepatosit. Dalam kultur pertama, hepatosit sihat, pada yang kedua mereka dirawat dengan bahan ujian dan akhirnya pada yang ketiga mereka dirawat dengan bahan kawalan yang tentunya bersifat karsinogenik.Ketiga kultur ini mengandungi asas pyrimidine radioaktif, yang merupakan tritiated thymidine, yang bertindak sebagai penanda.

Sekiranya kompaun yang diperiksa menyebabkan mutasi dalam DNA, sel bertindak balas terhadap masalah ini dengan mengaktifkan sistem pembaikan. Potongan DNA yang telah mengalami mutasi dipotong dan berkat tindakan DNA polimerase, potongan yang hilang diganti dengan yang baru. Untuk pembetulan, DNApolymerase menggunakan pangkalan baru, termasuk thitiidin tritiasi. Asas radioaktif dimasukkan. Analisis radioaktiviti menentukan tahap mutasi pada sel yang dirawat: semakin tinggi radioaktiviti, semakin besar mutasi DNA.

Juga pada fasa B ujian juga dilakukan terhadap bakteria, untuk dapat mengkaji jika terdapat mutasi terbalik. Bakteria yang digunakan adalah salmonellae yang sudah menjadi pembawa mutasi. Mutasi berkenaan dengan sintesis histidin, jadi salmonellae tidak dapat tumbuh tanpa histidin. Koloni bakteria ini sebahagiannya diambil untuk dirawat dengan bahan ujian, sebahagiannya untuk kawalan negatif dan sebahagiannya untuk kawalan positif, kemudian diuji dengan karsinogen yang diketahui. Sekiranya bahan ujian ini adalah genotoksik tidak langsung, enzim metabolisme mesti dimasukkan ke dalam media kultur. Pada tahap ini ada 3 kultur yang akan disemai dan ditanam dalam piring petri (tidak ada histidin dalam media kultur). Sekiranya tidak ada mutasi oleh karsinogen yang akan diuji, secara teori tidak boleh ada di piring Sekiranya terdapat tindakan mutagenik karsinogen, ia mungkin telah mengubah mutasi pertama dan menciptakan mutasi kedua yang mampu menumbuhkan bakteria pada medium kultur bebas histidin. Dalam kes ini, mutasi kedua yang mengubah mutasi pertama dan mengambil nama RETROMUTASI Akhirnya, jika pertumbuhan yang ketara berlaku di piasta petri, karsinogen adalah langsung.
Selalu dengan ujian in vitro adalah mungkin untuk menentukan integriti kromosom. Ujian ini selalu dilakukan pada sel mamalia dan digunakan untuk menguji bahan toksik yang mampu menyebabkan mutasi pada beberapa enzim yang bertanggungjawab terhadap biosintesis DNA. Bahan yang akan diuji dikenakan analisis in vitro Untuk dapat menentukan sama ada bahan yang diperiksa mempengaruhi integriti dan bilangan kromosom yang ada, ujian mikronukleus digunakan. Mikronuklei adalah vesikel yang terbentuk dengan bahagian kromatin di dalamnya. Kromatin yang dimasukkan dalam mikronuklei ini boleh berupa kromosom utuh atau serpihan kromosom. Mikronukleus dibentuk oleh pembahagian sel yang salah sehingga menimbulkan sel anak dengan bahan genetik yang tidak sama diedarkan. Hasil ujian ini adalah penentuan bahan yang ditakrifkan sebagai racun clastogenic dan spindle. Bahan clastogenic menghasilkan mikronuklei dengan serpihan kromosom acentrik sehingga bahan tersebut menyebabkan kerosakan pada kromosom, sebaliknya bahan racun dari spindle menghasilkan mikronuklei yang terdapat di dalamnya terdapat kromosom keseluruhan.
Sekiranya bahan yang diperiksa menyebabkan genotoksisitas dalam satu atau lebih ujian, ini ditakrifkan sebagai sangat mencurigakan, jadi ia langsung menuju ke fasa D. Sekiranya, sebaliknya, bahan yang diuji tidak menghasilkan kesan genotoksik, ia akan melalui fasa kajian C kerana boleh menjadi penganjur.

FASEC: dalam fasa ini ujian in vitro dan in vivo dapat dilakukan.

Untuk ujian in vitro dapat ditunjukkan kemungkinan zat penyokong untuk memecahkan jurang persimpangan antara sel normal dan sel tumor, dengan berlalunya zat antara kedua sel tersebut.

Ujian in vivo adalah induksi tumor kulit pada tikus. Bahan yang akan diuji digunakan dua atau tiga kali dalam seminggu pada kulit tikus. Dalam masa 2/3 bulan jika bahan ini menjadi pendorong mungkin terdapat formasi papilloma. Pada tikus, dua data utama dipertimbangkan: jumlah tikus yang terkena papilloma dan jumlah papilloma yang terdapat pada setiap haiwan. Sekiranya bahan tersebut bertindak sebagai pendorong dan menghidap tumor pada tetikus yang dirawat, ia bermaksud bahawa ia adalah bahan yang mempunyai kesan penggalak.

Setelah ujian ini selesai, kami beralih ke ujian in vivo jangka panjang.

FASED: dalam fasa ini semua sebatian yang membuktikan mutagenik dan semua sebatian yang tidak membuktikan mutagenik diuji. Ujian yang boleh dilakukan adalah berbeza, beberapa di antaranya adalah ujian yang dilakukan pada hati, paru-paru dan akhirnya pada payudara.

Ujian hati menunjukkan pembentukan bukan tumor yang baru terbentuk, tetapi fokus pada neoplastik, oleh itu sesuatu yang sedang bersiap untuk menjadi tumor. Sel-sel fokus ini sudah sel yang tidak biasa, oleh itu mereka telah mengalami mutasi dan bersiap untuk menjadi sel neoplastik. Selepas masa tertentu, berkat pemeriksaan autopsi, pembentukan fokus pra-neoplastik ditentukan, dengan mengira bilangan dan luas formasi pra-neoplastik ini.

Ujian paru-paru memungkinkan penentuan adenoma, yang merupakan "anomali sel-sel tisu paru-paru. Juga dalam hal ini tisu paru-paru tikus diperiksa setelah waktu yang cukup lama (bulan) (adenoma ini mudah dikenali kerana adalah nodul keputihan pada epitel paru).
Ujian payudara membolehkan penentuan tumor pada tisu kelenjar. Bilangan adenoma yang terbentuk dan bilangan haiwan yang menunjukkan adenoma selalu dinilai.

Sekiranya terdapat keputusan positif dari ujian ini, bahan ujian benar-benar karsinogen. Pada ketika ini kita terus melakukan ujian mahal dengan masa pelaksanaan yang sangat lama.

FASA: dalam fasa ini sejumlah haiwan yang berubah-ubah, dari 20 hingga 50 tahun, menjalani ujian jangka panjang.Ujian ini sangat mahal dan memerlukan masa yang lama untuk mendapatkan hasil tertentu; kita membicarakan kira-kira 1/8 kehidupan haiwan. Ada kemungkinan bahawa semasa proses ujian ini beberapa haiwan mati, tetapi mereka selalu dikaji dengan autopsi dan pemeriksaan jenis histologi. Haiwan yang dipilih selalu tikus dan tikus dan hanya 70-80% yang bertahan sehingga akhir ujian jangka panjang. Haiwan yang digunakan hanya disapih, semakin muda, semakin sensitif terhadap rawatan. Dalam jangka masa ujian jangka panjang, penyelidik sentiasa disokong oleh ahli matematik-statistik, dapat mengambil kira semua maklumat yang dikumpulkan dan menghasilkan semula pelbagai data.

Dos yang diuji pada haiwan bermula dari dosis maksimum yang ditoleransi dan semua kelipatannya, dan tindak balas tindak balas dos pada haiwan dinilai.
Pentadbiran mesti selalu menghampiri laluan di mana lelaki itu boleh bersentuhan dengan bahan yang diperiksa, oleh itu cara oral, kulit atau pernafasan, sementara jika karsinogenik ubat diuji, juga berguna untuk melakukan pemberian intravena.
Kumpulan haiwan yang diuji adalah 4 (50 haiwan untuk setiap kumpulan):

Kumpulan NAIF yang tidak mempunyai rawatan;
Kumpulan yang dirawat dengan kenderaan;
Kumpulan yang dirawat dengan bahan ujian;
Kumpulan yang dirawat dengan karsinogen yang diketahui.

Adalah sangat penting bahawa bilangan haiwan dalam setiap kumpulan adalah setara yang mungkin. Sebenarnya, jika terdapat terlalu banyak perbezaan dalam jumlah haiwan, maka ujian statistik boleh menjadi palsu.
Penilaian yang dijalankan adalah:

Jumlah kekerapan tumor;
Kekerapan beberapa tumor;
Kekerapan haiwan dengan lebih daripada satu jenis tumor;
Bilangan barah haiwan.

Pada akhir semua fasa kajian ini, bahan tersebut diklasifikasikan dalam peringkat yang ditetapkan oleh IARC (International Agency for Research and Development on Cancer) dan oleh Environmental Protection Agency (EPA).